一、 原理? 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等**样本中的AHD，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免*化学反应的原理来进行的，样本中的AHD和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的AHD含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃妥因代谢物含量。 ? 二、 试剂盒技术指标： 试剂盒灵敏度：??????????0.1 ppb 样本检测下限： **、蜂蜜????????????? 0.2 ppb 鱼/虾等水产品**因存在一定的干扰，检测下限为0.3 ppb 回收率： 鱼/虾水产**?????????????  90％±15％ 蜂蜜/鸡肉/肝脏样本??????? ?? 80％±15％ 交叉反应率： 呋喃妥因代谢物???????????? 100％ 呋喃唑酮代谢物?????????? ??0.1％ 呋喃它酮代谢物??????????? ?0.1％ 呋喃西林代谢物??????????? ?0.1％ ? 三、试剂盒组成 1．微量测试孔：96T/8孔 2．标准品液： 0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb（1.0 ml/瓶） 3．酶标记物??????????? 12 mL 4．抗体工作液??????? ?? 7 mL 5．底物缓冲液???????? ? 7 mL 6．底物液?????????????  7 mL 7．终止液??????????? ?? 7 mL 8．20倍浓缩洗涤液????  50 mL 9．复溶液???????????? ? 50 mL 10．15.1 mg衍生化试剂 ? 四、 所用仪器、试剂 仪器：微孔酶标仪、振荡器、离心机、天平（感量0.01 g） 各种量程微量移液器 试剂：甲醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁**钾（K2Fe（CN）5?NO?3H2O）、ZnSO4?7H2O ? 五、样本前处理步骤 样本处理前须知 处理任何样本时，都必须注意： 1、实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 2、实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。 样本前处理需配制： 1、衍生化试剂 称15.1 mg邻硝基苯甲醛加甲醇10 mL溶解(浓度10 mM) 2、C液：（供奶样用）称12.5 g 亚硝基铁**钾用去离子水定溶至100 mL。 3、D液：（供奶样用）称29.8 g **锌用去离子水溶解定溶至100 mL。 4、0.1 MK2HPO4?称22.8 g K2HPO4?3H2O加去离子水溶解定溶至1000 mL 5、1 M HCl? 取8.6 mL浓HCl加水定溶至100 mL。 6、1 M NaOH 称取4 g NaOH加水定溶至100 mL。 样本的处理 （a）鱼虾和肉样 用均质器均质样本，接(d)的描述方法。 （b）奶样 1、取出5 mL的样本到玻璃离心管中，分别加入C液和D液各250 μL； 2.、用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000 r/min以上离心10 min,4-12 ℃。如果没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8 ℃，然后离心； 3、接(d)的描述方法 （c）蜂蜜 1、取1 g样本到离心管中； 2、加入4 mL的蒸馏水振荡溶解，0.5 mL 1 M HCL和100 μL衍生化试剂，充分振荡； 3、接(d)第2步描述方法。 （d）接上面的方法 1、 取1±0.05 g的均质物（鱼虾/肉样）、牛奶的离心上清液1.1 mL（相当于1 mL的奶样），分别加入4 mL的蒸馏水,0.5 mL 1 M HCL和100 μL衍生化试剂，充分振荡； 2.、在56 ℃过夜孵育（2 h）； 3、 分别加入5 mL 0.1 M K2HPO4?，0.4 mL 1 M NaOH和5 mL的乙酸乙酯，剧烈振荡30 s； 4、 在室温下（20-25 ℃）4000 r/min以上离心10 min； 5、 取出2.5 mL的乙酸乙酯到另一个容器中于50 ℃氮气/空气吹干。 6、 用1 mL正己烷溶解干燥物，用1 mL已稀释好的复溶液充分混合；在室温下?? （20-25 ℃）4000 r/min以上离心10 min； 7、 取50 μL下层用于分析。 样本稀释倍数：2 ? 六、操作步骤 1、 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷冻。 3、 加标准品/样本50 μL /孔，然后加入抗体工作液50 μL/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，室温反应30 min。 4、 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5、 加入酶标记物100 μL /孔，用封板膜盖板，室温反应20 min。 6、 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 7、 显色：每孔加入底物缓冲液50 μL，再加底物液50 μL，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色10 min。 8． 测定：每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处（在20 min内读完数据），测定吸光度值。 ? ? 七、结果判定 以标准品百分吸光率为纵坐标，以AHD标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AHD实际浓度。 ? 八、注意事项 1、室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20-25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。 2、洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。 4、反应终止液为2 M**，避免接触皮肤。 5、将不用的微孔板放进自封袋重新密封 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 6、不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。 7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。 ? 九、储藏条件和保质期 储藏条件：试剂盒于2-8 ℃保存，不要冷冻。 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒